প্রয়োজনীয় প্রোটিন বিশুদ্ধতা ডিগ্রী প্রোটিন এর উদ্দেশ্যে শেষ ব্যবহারের উপর নির্ভর করে।
কিছু অ্যাপ্লিকেশনের জন্য, একটি অশোধিত নির্যাস যথেষ্ট। যাইহোক, অন্যান্য ব্যবহারের জন্য, যেমন খাদ্য এবং ফার্মাসিউটিকাল হিসাবে, বিশুদ্ধতা একটি উচ্চ স্তরের প্রয়োজন হয় এই কয়েকটি প্রোটিন শুদ্ধীকরণ পদ্ধতি অর্জনের জন্য সাধারনত শুদ্ধকরণের ধাপগুলির একটি সিরিজ ব্যবহার করা হয়।
প্রতিটি প্রোটিন শুদ্ধি ধাপ সাধারণত কিছু পণ্য ক্ষতির মধ্যে কিছু ফলাফল। অতএব, একটি আদর্শ প্রোটিন শুদ্ধিকরণ কৌশল হল এমন এক যা উচ্চতর স্তরের কিছু সংখ্যক পদক্ষেপে পৌঁছে যায়। যে পদক্ষেপগুলি ব্যবহার করা হয় তা হল টার্গেট, আকার, চার্জ, দ্রাব্যতা এবং লক্ষ্য প্রোটিনের অন্যান্য বৈশিষ্ট্যগুলির উপর নির্ভরশীল। নিম্নলিখিত পদ্ধতিগুলি একক সাইটোসোলিক প্রোটিনকে শুদ্ধ করার জন্য সবচেয়ে উপযুক্ত। সাইটসোলিক প্রোটিন কমপ্লেক্সের পরিশোধন আরও জটিল এবং সাধারণত বিভিন্ন পদ্ধতি প্রয়োগ করা প্রয়োজন।
প্রোটিন পরিশোধন জন্য প্রথম ধাপ
ঘনত্ব (কোষের ভিতরে) প্রোটিন বিশুদ্ধকরণের প্রথম ধাপ হচ্ছে একটি অশোধিত নির্যাস প্রস্তুত।
এই এক্সট্র্যাক্টটিতে কোষের সাইপ্রোটজমের সমস্ত প্রোটিনগুলির একটি জটিল মিশ্রণ থাকবে, এবং কিছু অতিরিক্ত ম্যাক্রোমুলিকুলস, কোফেক্টর এবং পুষ্টি। জৈবপ্রযুক্তি ক্ষেত্রে কিছু অ্যাপ্লিকেশনের জন্য অশোধিত নির্যাস ব্যবহার করা যেতে পারে, তবে বিশুদ্ধতা একটি বিষয় হলে, পরবর্তী শুদ্ধকরণের পদক্ষেপ অনুসরণ করা আবশ্যক।
সেল লিসিস দ্বারা উৎপন্ন সেলুলার ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করে কাঁচা প্রোটিন তৈরি করা হয়, যা রাসায়নিক ও এনজাইম , সোয়ানোশন বা ফ্রেঞ্চ প্রেস ব্যবহার করে পাওয়া যায়। ধ্বংসাবশেষ সেন্ট্রিফিউজেশন দ্বারা সরানো হয়, এবং পৃষ্ঠতলের স্থান উদ্ধার করা হয়। সেন্ট্রিফিউজেশন দ্বারা কোষগুলি সরানোর মাধ্যমে বহিরাগত প্রোটিনের অনিয়মিত প্রস্তুতিগুলি পাওয়া যেতে পারে।
নির্দিষ্ট জৈবপ্রযুক্তি অ্যাপ্লিকেশনের জন্য, থার্মোস্টেবল এনজাইমগুলির জন্য একটি দাবি রয়েছে: এনজাইমগুলি যেগুলি নিখুঁত তাপমাত্রা নিঃসরণ ছাড়াই সহ্য করতে পারে এবং উচ্চ সুনির্দিষ্ট কার্যকলাপ বজায় রাখতে পারে। তাদের উৎপাদিত অর্গানিজমের কখনও কখনও চরমপন্থী বলা হয়। তাপ-প্রতিরোধী প্রোটিন শুদ্ধ করার সহজ পদ্ধতি হল গরম করার দ্বারা মিশ্রণের অন্যান্য প্রোটিনগুলিকে বিক্রিয়া করা, তারপর সমাধানটি ঠান্ডা করা হয় (এইভাবে থার্মেস্টেবল এনজাইমটি যদি প্রয়োজন হয় তবে তা সংস্কার বা পুনঃবিন্যস্ত করার অনুমতি দেয়। ডিএনফেক্ট প্রোটিনগুলি সেন্ট্রিফিউজেশন দ্বারা সরানো যায়।
ইন্টারমিডিয়েট পরিশোধন ধাপ
অতীতে, একটি অশোধিত নির্যাস থেকে প্রোটিন বিশুদ্ধ করা একটি সাধারণ দ্বিতীয় ধাপ উচ্চ osmotic শক্তি (যেমন লবণ সমাধান) সঙ্গে একটি সমাধান বৃষ্টিপাত ছিল। স্ট্রেটোমোমাইকিন সালফেট বা প্রোটামাইন স্যালফেট দিয়ে তৈরি সংবহারগুলি ছড়ায়, কাঁচা নির্যাসের নিউক্লিক অ্যাসিডগুলি সরিয়ে ফেলা যায়।
প্রোটিন বৃষ্টিপাত সাধারণত লবণ হিসাবে অ্যামোনিয়াম সালফেট ব্যবহার করে কাজ করে।
বিভিন্ন প্রোটিন অ্যামোনিয়াম সিলফেট বিভিন্ন ঘনত্ব মধ্যে নিবিড় হবে। সাধারণভাবে, অ্যামোনিয়াম সলফেটের নিম্ন কেন্দ্রে উচ্চতর আণবিক ওজনের প্রোটিন। লবণ বৃষ্টিপাত সাধারণত একটি অত্যন্ত শুদ্ধ প্রোটিন হতে পারে না কিন্তু মিশ্রণে কিছু অবাঞ্ছিত প্রোটিন নির্মূল এবং নমুনা মনোনিবেশ করতে সহায়তা করতে পারে। সমাধান মধ্যে সাল্ট তারপর porous সেলুলোজ পাইপ, পরিস্রাবণ, বা জেল বর্জনের ক্রোমাটোগ্রাফী মাধ্যমে ডায়ালিসিস দ্বারা মুছে ফেলা হয়।
আধুনিক বায়োটেক প্রোটোকলগুলি বেশিরভাগ বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ক্যাটের সুবিধা গ্রহণ করে যা স্ট্যান্ডার্ড পদ্ধতির জন্য প্রস্তুতকৃত সমাধান প্রদান করে। প্রোটিন পরিশোধন প্রায়ই ফিল্টার এবং প্রস্তুত জেল পরিস্রাবণ কলাম ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়। আপনাকে যা করতে হবে তা হল নির্দেশাবলী অনুসরণ করুন এবং সঠিক সমাধানের ডান ভলিউমটি যুক্ত করুন এবং নির্দিষ্ট টাওয়ারে এলুয়ান (কলামের অন্য প্রান্তে কী আসে) সংগ্রহ করার সময় নির্দিষ্ট সময়ের জন্য অপেক্ষা করুন।
- ক্রোমাটোগ্রাফিক পদ্ধতি বেঞ্চ-শীর্ষ কলাম বা স্বয়ংক্রিয় এইচপিএলসি সরঞ্জাম ব্যবহার করে প্রয়োগ করা যেতে পারে। এইচপিএলসি দ্বারা পৃথকীকরণ রিভার্স-ফেজ, আয়ন-বিনিময় বা আকার-বহির্ভুতকরণ পদ্ধতি এবং ডায়োড অ্যারে বা লেজার প্রযুক্তি দ্বারা সনাক্ত নমুনা দ্বারা করা যেতে পারে।
প্রোটিন ভিজ্যুয়ালাইজেশন এবং পরিশোধন মূল্যায়ন
- বিপরীত ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি (RPC) তাদের আপেক্ষিক হাইড্রোফোবিটিটিগুলির উপর ভিত্তি করে প্রোটিনকে পৃথক করে। এই কৌশল অত্যন্ত নির্বাচনযোগ্য কিন্তু জৈব দ্রাবক ব্যবহার প্রয়োজন। কিছু প্রোটিন স্থায়ীভাবে সলভেন্টস দ্বারা বিকৃত করা হয় এবং RPC এর সময় কার্যকারিতা হারাবে। অতএব এই পদ্ধতি সব অ্যাপ্লিকেশনের জন্য সুপারিশ করা হয় না, বিশেষ করে যদি লক্ষ্য উদ্বেগ প্রক্রিয়াকরণের জন্য প্রয়োজনীয়তা বজায় রাখা হয়।
- আইওন-বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফি চার্জের উপর ভিত্তি করে প্রোটিন বিচ্ছেদকে বোঝায়। কলামগুলিও আয়ন বিনিময় বা cation বিনিময় জন্য প্রস্তুত করা যেতে পারে। আয়নন বিনিময় কলামগুলির একটি ইতিবাচক চার্জ সঙ্গে একটি স্থির ফেজ ধারণ করে যা নেতিবাচকভাবে চর্চা প্রোটিন আকর্ষণ করে। Cation বিনিময় কলাম বিপরীত, নেগেটিভ চার্জিং জপমালা যা ইতিবাচক চার্জ প্রোটিন আকর্ষণ। লক্ষ্য প্রক্রিয়াকরণ (গুলি) কলামে pH পরিবর্তন করে করা হয়, যা প্রতি প্রোটিনের চার্জযুক্ত কার্যকরী গ্রুপগুলির পরিবর্তন বা নিরপেক্ষতা হিসাবে দেখা দেয়।
- আকার-বর্জনের ক্রোমাটোগ্রাফি ( জেল পরিস্রাবণ ) ছোট ছোট প্রোটিনগুলিকে আলাদা করে দেয় কারণ বড় অণুগুলো ক্রোম-লিঙ্কযুক্ত পলিমারের মাধ্যমে দ্রুত ক্রোমাটোগ্রাফি কলামে ভ্রমণ করে। বৃহৎ প্রোটিন পলিমারের ছিদ্রের মধ্যে মাপসই হয় না যখন ছোট প্রোটিনগুলি কম করে এবং ক্রোমাটোগ্রাফি কলামের মাধ্যমে ভ্রমণ করতে দীর্ঘ সময় নেয়, তাদের কম সরাসরি রুট মাধ্যমে। এলুয়েট একটি এলিউশ সিরিজ সংক্রামক সংগ্রহ করা হয় যা এলিউশন সময় অনুসারে প্রোটিনকে পৃথক করে। জেল পরিস্রাবণ একটি প্রোটিন নমুনা মনোযোগ কেন্দ্রীভূত করার জন্য একটি দরকারী হাতিয়ার। কারণ এটি প্রাথমিকভাবে কলামের সাথে যুক্ত একটি ক্ষুদ্র ক্ষুদ্র অংশে লক্ষ্যমাত্রা প্রক্রিয়াকৃত হয়। অনুরূপ পরিস্রাবণ কৌশল কারণ তাদের খরচ কার্যকারিতা বড় আকারের প্রোটিন উত্পাদন সময় ব্যবহার করা যেতে পারে।
- এফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি "মসৃণকরণ" বা প্রোটিন শুদ্ধকরণ প্রক্রিয়া সম্পন্ন করার জন্য একটি অত্যন্ত কার্যকর কৌশল। ক্রোমাটোগ্রাফি কলামের জপমালাটি লিগ্যান্ডগুলির সাথে ক্রস-লিঙ্কযুক্ত হয় যা বিশেষ করে লক্ষ্যমাত্রা প্রোটিনকে বাঁধে। প্রোটিন তারপর কলম থেকে মুক্ত ligands ধারণকারী সমাধান সঙ্গে rinsing দ্বারা মুছে ফেলা হয়। এই পদ্ধতি অন্যান্য কৌশল তুলনায় purest ফলাফল এবং সর্বোচ্চ নির্দিষ্ট কার্যকলাপ দেয়।
- এসডিএস-পৃষ্ঠা হচ্ছে পলিিয়াক্রাইলাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরিসিসিস, এসডিএস (সোডিয়াম ডডাইসিলে সলফেট) উপস্থিতিতে সঞ্চালিত হয় যা প্রোটিনকে একটি বৃহৎ নেট নেতিবাচক চার্জ প্রদান করে। যেহেতু সমস্ত প্রোটিন চার্জ মোটামুটি সমান, তাই এই পদ্ধতিটি সম্পূর্ণভাবে আকারের উপর ভিত্তি করে তাদের পৃথক করে। এসএসএস-পৃষ্ঠাটি প্রায়ই একটি সিরিজের প্রতিটি ধাপের পর প্রোটিনের বিশুদ্ধতা পরীক্ষা করতে ব্যবহৃত হয়। হিসাবে অ্যান্টিভাইরাস প্রোটিন ধীরে ধীরে মিশ্রণ থেকে সরানো হয়, এসডিএস-পৃষ্ঠা জেল দৃশ্যমান ব্যান্ড সংখ্যা হ্রাস করা হয়, যতক্ষণ পর্যন্ত শুধুমাত্র পছন্দসই প্রোটিন প্রতিনিধিত্বকারী এক ব্যান্ড আছে
- Immunoblotting একটি প্রোটিন ভিজ্যুয়ালাইজেশন কৌশল আতিথেয়তা ক্রোমাটোগ্রাফি সঙ্গে মিশ্রিত প্রয়োগ। একটি নির্দিষ্ট প্রোটিন জন্য অ্যান্টিবডি একটি অনুভূতি ক্রোমাটোগ্রাফি কলাম নেভিগেশন ligands হিসাবে ব্যবহার করা হয়। লক্ষ্য প্রোটিন কলামে রাখা হয়, তারপর একটি লবণ সমাধান বা অন্যান্য এজেন্ট সঙ্গে কলাম rinsing দ্বারা মুছে ফেলা। তেজস্ক্রিয় বা ছোপানো লেবেলগুলির সাথে সংযুক্ত অ্যান্টিবডিগুলি লক্ষ্য প্রক্রিয়াকরণের খোঁজে এটির বাকি অংশ থেকে আলাদা হয়।
সূত্র:
জুবায় জি। 1988. জৈব রসায়ন, ২ য় সংস্করণ। ম্যাকমিলান প্রকাশনা সংস্থা, নিউ ইয়র্ক, এনওয়াই, ইউএসএ।
আমস্টারসাম ফার্মাসিয়া বায়োটেক। 1999. প্রোটিন পরিশোধন হ্যান্ডবুক, সংস্করণ এবি। আমস্টারসাম ফার্মাসিয়া বায়োটেক ইনকর্পোরেটেড নিউ জার্সি, ইউএসএ http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf।