ডিএনএ সিকোয়েন্সিং জেল ইলেক্ট্রোফোরিসিসের ডিএনএর পৃথক পৃথক করার ক্ষমতাও নির্ভর করে। এটি একটি বেস জুড়ি হিসাবে যতটা আকারে আলাদা করে থাকে।
ডিএনএ শৃঙ্খলা
1970 এর দশকের শেষের দিকে ডিএনএর অণুগুলির দুটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং কৌশল উদ্ভাবিত হয়েছিল। এই Sanger (বা dideoxy) পদ্ধতি এবং Maxam- গিলবার্ট (রাসায়নিক ছিদ্র) পদ্ধতি ছিল। ম্যাক্সম-গিলবার্ট পদ্ধতিটি নিউক্লিওটাইড-ভিত্তিক সংশ্লেষের উপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয় এবং এটি সর্বোৎকৃষ্ট oligonucleotides (সংক্ষিপ্ত নিউক্লিওটাইড পলিমার, যা সাধারণত 50 বেস-জোড়া দৈর্ঘ্যের চেয়ে ছোট) ক্রম অনুসারে ব্যবহৃত হয়। স্যাঙ্গার পদ্ধতিটি আরো সাধারণভাবে ব্যবহৃত হয় কারণ এটি প্রয়োগ করার জন্য টেকনিক্যালি সহজে প্রমাণিত হয়েছে এবং পিসিআর এবং আধুনিকীকরণের কৌশলটি সহজেই ডিএনএর দীর্ঘ শৃঙ্খলে প্রয়োগ করা হয় যা কিছু সম্পূর্ণ জীন সহ। এই কৌশলটি পিসিআর বৃদ্ধির প্রতিক্রিয়াগুলির সময় ডাইডিক্সিনেলেলোটাইড দ্বারা শৃঙ্খলা পরিমাপের উপর ভিত্তি করে।
Sanger পদ্ধতি
স্যাঙ্গার পদ্ধতিতে বিশ্লেষণের জন্য ডিএনএর তড়িৎকে একটি টেমপ্লেট হিসেবে ব্যবহার করা হয় এবং পিএনআরএর প্রতিক্রিয়াতে ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করা হয়, যা প্রাইমারে ব্যবহার করে প্রশংসনীয় ফাঁকা তৈরি করে।
চারটি ভিন্ন পিসিআর প্রতিক্রিয়া মিশ্রণ প্রস্তুত করা হয়, প্রতিটি ডিডাইঅক্সিনেক্লিওসাইড ট্রাইফসফেট (ডিডিএনটিপি) এনালগগুলি চারটি নিউক্লিওটাইড (এ.পি.পি., সিটিপি, জিটিপি বা টিটিপি) এর একটি নির্দিষ্ট শতাংশ ধারণকারী। এই এনালগগুলি অন্তর্ভুক্ত না হওয়া পর্যন্ত নতুন ডিএনএ স্ট্র্যান্ডের সংশ্লেষণটি চলতে থাকবে, এ সময় কৃমিটি আগেভাগেই ছড়ায়।
প্রতিটি পিসিআর প্রতিক্রিয়া ডিএনএ সারগুলির বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের মিশ্রণ ধারণ করে শেষ হবে, সব নিউক্লিওটাইডের সাথে শেষ যা এই প্রতিক্রিয়ায় ডাইডিক্সি লেবেলযুক্ত ছিল। জেল ইলেক্ট্রোফোরিসিসটি তখন চারটি পৃথক লাইনের চারটি প্রতিক্রিয়াগুলি পৃথক করার জন্য ব্যবহৃত হয় এবং মূল টেমপ্লেটের ক্রমটি নির্ধারণ করে যা নিউইউলিয়েটাইডের সাথে কি ধরনের লম্বালির শেষ হয়।
স্বয়ংক্রিয় Sanger প্রতিক্রিয়া ইন, primers ব্যবহৃত হয় যে চার ভিন্ন রঙের ফ্লোরোসেন্ট ট্যাগ সঙ্গে লেবেল করা হয়। পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলি, বিভিন্ন ডাইডিওক্সিক নিউক্লিওটাইডের উপস্থিতিতে উপরে বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়। যাইহোক, পরবর্তী চারটি প্রতিক্রিয়া মিশ্রণগুলি মিলিত হয় এবং একটি জেলের একক লাইন প্রয়োগ করা হয়। প্রতিটি টুকরা রঙের একটি লেজারের মরীচি ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয় এবং তথ্য একটি কম্পিউটার দ্বারা সংগৃহীত হয় যা প্রতিটি রঙের জন্য শিখর প্রদর্শন করে ক্রোমাটোগ্রাম তৈরি করে, যার মাধ্যমে টেমপ্লেট ডিএনএ ক্রম নির্ধারণ করা যায়।
সাধারণত, স্বয়ংক্রিয় সিকোয়েন্সিং পদ্ধতিটি সর্বোচ্চ দৈর্ঘ্যের প্রায় 700-800 বেস-জোড়া পর্যন্ত সিকোয়েন্সের জন্য সঠিক। যাইহোক, বৃহত্তর জিনের পূর্ণ অনুক্রম প্রাপ্ত করা এবং প্রকৃতপক্ষে, পুরো জিনোমগুলি, প্রাইমার ওয়াচিং এবং শটগন সিকোয়েন্সিং এর মতো ধাপে-পদ্ধতির পদ্ধতি ব্যবহার করে।
প্রাইমার হাঁটার মধ্যে , একটি বৃহত্তর জিনের একটি কার্যকর অংশ স্যাঙ্গার পদ্ধতি ব্যবহার করে ক্রমশ। নতুন প্রাইমার্কগুলি ক্রম এর একটি নির্ভরযোগ্য সেগমেন্ট থেকে উত্পন্ন হয় এবং মূল প্রতিক্রিয়াগুলির পরিসীমা থেকে বেরিয়ে আসা জিনের অংশকে ক্রমানুসারে ক্রমানুসারে চালিয়ে যেতে ব্যবহৃত হয়।
শটগান সিকোয়েন্সিংটি অবাধে ডিএনএ সেগমেন্টকে আরও উপযুক্ত (পরিচালনযোগ্য) আকারের টুকরো টুকরো করে কাটাচ্ছে, প্রতিটি টুকরা সিকোয়েন্স করে এবং ওভারল্যাপিং সিকোয়েন্সের উপর ভিত্তি করে টুকরাগুলি সাজানো। ওভারল্যাপিং টুকরাগুলি সাজানোর জন্য এই টেকনিকটি কম্পিউটার সফটওয়্যারের অ্যাপ্লিকেশন দ্বারা সহজ করা হয়েছে।